一、背景及应用介绍
支原体是一类没有细胞壁、形态多变、尺寸极小的简单原核生物。它们既是重要的人类和动物病原体，也是细胞培养中棘手且危害巨大的污染物。有报道显示Giemsa染色血细胞感染支原体，SEM透射电镜，以及激光共聚焦Confocol染色观察细胞感染支原体[1,2,3]。见图1，2。
图1
图2
支原体对细胞治疗产品的具体危害：
1. 对细胞本身的影响
（1）改变细胞生物学功能：与细胞竞争营养，分泌代谢废物，抑制细胞增殖和代谢，甚至导致细胞死亡。
（2）干扰细胞基因表达：改变宿主细胞的DNA、RNA和蛋白质合成，可能导致治疗性细胞（如CAR-T细胞、干细胞）关键功能丧失（如杀伤肿瘤能力、分化潜能）。
（3）引起遗传不稳定性：可能导致宿主细胞染色体畸变，带来不可预见的风险。
2. 对患者的风险
（1）引发全身性感染：细胞产品被直接回输至患者体内，大量支原体可导致败血症或菌血症，对免疫系统脆弱的患者是致命威胁。
（2）加剧细胞因子释放综合征（CRS）：支原体成分可能触发或加剧CRS，导致难以控制的炎症风暴。引起过敏反应等其他免疫副作用。
（3）导致治疗失败：受污染的细胞产品可能完全失效，患者不仅无法获益，更可能错过最佳治疗时机。
3. 对生产过程的挑战
（1）交叉污染：支原体极易在培养箱、操作台、培养基等之间传播，污染整个生产线。
（2）检测耗时：法规要求的培养法检测需28天，与细胞产品“现做现用”的紧迫时间窗口存在巨大矛盾。
监管与质量控制要求
鉴于其极端危害，全球监管机构（如FDA、EMA、NMPA）对支原体检测有强制性和放行必检的要求。传统方法有培养法和指示细胞培养法，但是NAT法灵敏度，检测效率更高，是发展趋势[1-9]。
检测标准：
（1）培养法：黄金标准，但耗时长达28天。
（2）指示细胞培养法（DNA荧光染色法）：常用替代方法，更快（约1周），灵敏度高，但操作繁琐。
（3）核酸扩增技术（NAT）：最快（1天内），灵敏度极高，已成为各国药典认可的重要方法（如qPCR法）。
在细胞治疗产品的研发与生产过程中，病原体污染可能导致严重的临床风险，而传统检测方法（如培养法）存在周期长、灵敏度不足等局限性。荧光定量PCR凭借其高灵敏度、快速和特异性强的优势，成为细胞治疗质量控制的关键技术。本试剂盒针对细胞治疗产品的特色需求开发，可精准检测多种病原体污染物，确保从细胞库建立到终产品放行的全流程安全性，为细胞治疗产品的合规化生产提供可靠保障。
二、产品目录
| 货号 | 产品名称 |
| MP-D050T/MP-D100T | 支原体qPCR检测试剂盒（荧光探针法） |
三、实验原理
TaqMan探针法是一种基于荧光定量PCR的检测技术，通过特异性引物和荧光标记的探针与目标核酸结合，探针5’端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，3’端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)。探针完整时，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光。在qPCR扩增过程中，Taq酶切割探针，使荧光报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，其强度与目标核酸数量成正比，从而实现高特异性、高灵敏度的定量分析。
四、试剂盒优势
超敏检测：灵敏度达1-10拷贝/μL，可识别极微量污染风险。
精准鉴别：探针特异性识别靶序列，避免假阳性/假阴性。
全程监控：覆盖从细胞建库、培养监控到终产品放行全流程。
应用广泛：适用细胞治疗、生物制药、科研等多个场景。
平台兼容：兼顾不同厂家及型号qPCR仪。
合规可靠：严格符合ChP/EP/USP等药典标准。
五、性能指标
符合《欧洲药典》(EP 2.6.7)、《美国药典》(USP 63)、《日本药典》(JP 18)中对支原体的检测要求。
1.灵敏度与检测限
使用本产品灵敏度可达至少10 CFU/mL，检出比例均达95%以上。
| 样本名称 | 菌株来源 | 浓度 | 阳性结果/总检测数 |
| 口腔支原体 | ATCC 23714 | 10 CFU/mL | 23/24 |
| 肺炎支原体 | ATCC 15531 | 10 CFU/mL | 24/24 |
| 猪鼻支原体 | CVCC 361 | 10 CFU/mL | 24/24 |
2.专属性与特异性
可特异性检测100多种支原体，与以下细菌、真菌、细胞基因组、培养基等无交叉反应，无CT值。
| 序号 | 菌株名称 | 序号 | 细胞名称 | 序号 | 溶液名称 |
| 1 | 大肠杆菌 | 8 | MDCK | 14 | PBS |
| 2 | 肺炎克雷伯菌 | 9 | 293T | 15 | FBS |
| 3 | 肺炎链球菌 | 10 | CHO-K1 | 16 | RPMI-1640培养基 |
| 4 | 金黄色葡萄球菌 | 11 | vero | 17 | MEM培养基 |
| 5 | 艰难梭菌 | 12 | Hela | 18 | CHO培养基 |
| 6 | 嗜酸乳杆菌 | 19 | L-G培养基 | ||
| 13 | BHK-21 | ||||
| 7 | 毕赤酵母 | 20 | PS培养基 |
3.基质效应
在以下基质中加入支原体标准品，试剂盒检测结果与性能不受影响。
| 序号 | 样本名称 |
| 1 | 293T 细胞 |
| 2 | 293T 细胞培养上清 |
| 3 | CHO-K1细胞 |
| 4 | CHO-K1细胞培养上清 |
| 5 | Vero 细胞 |
| 6 | Vero 细胞培养上清 |
| 7 | RPMI1640培养基 |
| 8 | DMEM培养基 |
| 9 | 10% FBS |
4.冻融稳定性
试剂盒经反复冻融1-5次，检测结果和性能不受影响。
5.重复性
试剂盒批内与批次间变异系数(CV)均小于10%，重复性好。
6.兼容性
使用不同品牌荧光定量PCR仪：ABI 7500、博日FQD-96A和BIO-RAD CFX96，检测相同样本，均可准确鉴定支原体阳性/阴性，ABI 7500灵敏度优于后两者。
六、检测结果（以支原体为例）
- 扩增曲线
2. 标准曲线
| 参数 | 标准 | |
| 标准曲线 | 斜率（Slope） | -3.1~-3.8 |
| 线性系数（R2） | >0.99 | |
| 扩增效率（Eff） | 90%-110% | |
| 质量控制 | 灵敏度（Sensitivity） | 10 CFU |
| 变异系数（CV） | ≤10% | |
| 特异性 | √ | |
| 专属性 | √ | |
| 耐用性 | √ |
本系列产品基于Taqman探针法，实现目标病原体核酸的定性和定量检测。适用于细胞治疗、生物制药、科研等领域，覆盖从细胞建库、培养监控到终产品放行的全流程，精准检测微生物（细菌、真菌、支原体、病毒）污染，符合药典标准及法规要求，为细胞治疗产品的安全性提供可靠保障。
Reference：
[1]Images by Martina Maritan.
[2]H S Çetin et al. Response to doxycycline and oxytetracycline treatments in cats infected with Mycoplasma spp. and analysis of haemato-clinical findings and risk factors. Trop Biomed. 2021. 38(2):149-158.
[3]B. B. A. Raymond, et al. Mycoplasma hyopneumoniae resides intracellularly within porcine epithelial cells. Scientific Reports. 2018. 8:17697.
[4] 《中国药典》，<3301>.
[5] USP <63> Mycoplasma Tests.
[6] European Pharmacopoeia 11th Edition，<2.6.7. Mycoplasmas>. Appendix: Nucleic acid amplification techniques.
[7] EMA Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells.
[8] ICH Q5A(R1): Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin.
[9]ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products.