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基因定点突变

作者:山东维真生物科技有限公司 2018-03-20T00:00 (访问量:5902)

实验原理

基因定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法改变目的基因的序列,包括碱基的插入、缺失、点突变等。基因定点突变是基因研究中比较常用的方法,可以短时间内研究目的DNA所表达的目的蛋白的性状及表征。

定点突变需要设计特定的突变引物。引物长度一般为25-45 bp,建议选择30-35bp长度的引物p。引物至少要11-12bp才能与模板搭上,而这种突变PCR要求引物两边都能与模板搭上,所以引物的两边各设至少12bp。以要突变的位点碱基为中心,加上两边11-12 bp的序列。若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败。同时需要设计一条反向互补的引物。为保证PCR反应正常进行,引物设计完成后需计算Tm值,若Tm值不合适,可以适量调整引物长度。

实验材料

PCR引物,质粒或者基因组模板,PCR BufferPCR用高保真酶,ddH2O

实验过程

1、PCR扩增

30 μL PCRphusion)体系如下:

成分

体积(ul

18.2

Buffer

6

DMSO

0.9

dNTP

0.6

0.3

引物F+R

1.5+1.501

DNA模板

 

 

2、胶回收

第一轮PCR产物需要进行胶回收后再进行二轮PCR

将第一轮PCR得到的条带进行切胶回收后,作为模板进行二轮PCR,二轮PCR的引物已第一轮PCR所用的两端引物。二轮PCR反应结束后需要进行纯化回收,为下一步的酶切做准备。

 

3、酶切

通过酶切回收目的基因片段、载体时,避开基因中的酶切位点,选择合适限制性内切酶。当酶切回收目的基因时要注意目的基因装在PENTER载体的位置。用限制性内切酶处理目的载体时,要将载体片段的量控制在2μg以内,并在酶切反应后进行去磷酸化处理。

 

30μL酶切体系

成分

体积(ul

载体DNA

1-2ug

10X Buffer

1

E1

0.8

E2

0.8

补足30ul

 

4、连接

根据片段的大小以及基因的亮度来调节片段连接的比例,一般亚克隆的连接体系如下

成分

体积(ul

载体DNA

2

目的基因

6

T4连接酶

1

T4 Buffer

1


将连接产物放于22℃保持1~2h

 

5、转化

1)冰上融化感受态DH5a,,加1ug/ul的质粒1ul10ul感受态中,冰上放置30min

242℃水浴锅中热休克90s,迅速转移至冰上2min-5mins

3)超净台内向各管含质粒的感受态中加入500ul-1ml高压过的LB培养基,37℃,低速培养1h

4)取100ul转化菌涂板,至菌液快干时,倒置于37℃恒温孵箱中培养12-16小时,次日观察菌落生长情况。

6、获取正确质粒

1)挑取转化子

挑去大肠杆菌转化子至正确的抗性培养基中(KANAAMP,并对HM号及孔号做好记录。

2)酶切验证

将提取好的质粒用合适的限制性内切酶进行酶切验证。

10μL酶切验证体系:

成分

体积(ul

质粒DNA

3

10X Buffer

1

E1

0.25

E2

0.25

5.5

 

37℃保持30min~1h后进行琼脂糖凝胶电泳。

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